뽕잎분말을 첨가한 당면의 생리활성 평가

Ⅰ. 서 론

당면은 고구마전분을 주원료로 제조되어 영양성분으로는 탄수화물이 대부분이지만 특유의 씹힘성과 조리 시 다른 식재료와 잘 어울려 조화로운 풍미를 주기 때문에 기호도가 높은 식품 중 하나다(Ryoo & Hong, 2009). 현재 우리나라 당면의 전체 시장규모는 2,150억으로 가정 및 업소에서 뿐만 아니라 단체급식에서의 사용량이 증가하고 있다. 이러한 조건에도 불구하고 당면의 품질향상 및 신제품개발에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다(Jeon et al., 2015).

그 동안의 당면연구로는 다양한 전분이나 쌀가루를 원료로 사용한 당면제조법(Ko & Kim, 1990; Lee et al., 2002; Seo, 2008), 당면의 이화학적 특성연구(Yook & Kim, 2001; Yook & Lee, 2001), 자몽종자 추출물을 처리한 당면의 저장성 연구(Kim et al., 2004a) 및 당면 제조공정별 위해요소 분석 연구(Cheon et al., 2012) 등이 있다. 최근, 명반으로 인한 고혈압, 간경화 등의 유발가능성이 알려지면서 당면 제조 시 물성보완제로 키토산을 이용한 연구(Cheon et al., 2012)와 당면의 향미, 천연색소 등의 안정성 및 품질향상을 위하여 베타-시클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 첨가한 연구(Lee & Shin, 2000)가 있을 뿐 아직까지 천연식물자원을 이용하여 당면의 생리활성을 향상시키고자 하는 연구는 많지 않다.

뽕잎은 여러 가지 생리활성물질이 다양하게 함유되어 있어 약리효과가 뛰어난 천연식물자원이다(Kim, 2005). 즉, 혈당강하 및 항당뇨 효과가 있는 DNJ(1-deoxynojirimycin), 혈압강하 효과가 있는 γ-aminobutyric acid(GABA) 및 항산화 효과가 있는 flavonoid 성분을 함유하고 있다(Bae & Ye, 2010; Chae et al., 2003). Kim(1999)은 뽕잎의 기능성 효과 규명에서 뽕잎에는 조단백질 25∼35%, 조지방 3.5%, 조섬유소 10.7%, 회분 7.2%, 탄수화물 20.2%를 함유하고 있으며, 필수 아미노산, 미네랄과 섬유소가 풍부하여 현대인의 생활습관병 예방효과가 높다고 보고하였다(Kim et al., 2003). 이와 같이 뽕잎은 다양한 기능성 성분으로 식품소재로서의 가치가 인정되어 빵·케이크류(Choi et al., 2007; Kim, 2003; Kim & Cho, 2010), 떡류(Kim et al., 2000; Nam et al., 2004), 강정(Yuh & Kim, 2001), 면류(Kim, 2002; Song et al., 2010), 김치(Lee & Rho, 2014a; Lee & Rho 2014b; Shin et al., 2007) 및 메밀묵(Kim & Seok, 2013) 등의 뽕잎을 이용한 제품개발이 이루어졌으나 현재 판매되고 있는 뽕잎제품은 뽕잎음료(Kang, 2015), 뽕잎김치(Shin, 2015) 등으로 시판제품은 다양하지 않다.

따라서 본 연구에서는 기존 당면의 생리활성을 향상시키고자 고구마전분, 키토산에 뽕잎분말과 베타-시클로덱스트린의 첨가량을 달리한 뽕잎당면을 부안지역 당면업체의 지원으로 제조한 후 무기질 함량, 항산화능과 항고혈압, 항당뇨 효소활성 분석을 실시였다. 이를 통하여 뽕잎의 생리활성능이 강화된 당면의 개발 및 상품화에 기여하고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

2. 뽕잎분말 첨가 당면의 제조

본 연구의 뽕잎당면 제조방법은 선행연구(Seo, 2008; Yook & Kim, 2001)와 실제 당면제조업체의 제조공정을 기본으로 하여 실시하였다(특허출원 10-2014-0177029). 뽕잎당면은 고구마전분(196∼200 g)과 키토산(0.4 g)에 증류수(170∼180 mL)를 첨가하여 혼합액을 만들었다. 그 다음에 뽕잎분말(0∼2.0%)과 β-cyclodextrin(0∼2.0%)을 전분(w/w)비율에 따라 일정 농도별로 첨가하여 호액을 형성한 후, 형성된 호액에 나머지 고구마전분을 진공기에 넣어 공기를 제거한 후 압출기를 통하여 당면을 성형하였다. 제조된 당면은 100℃의 물에 호화시킨 후, 15±5℃의 물에서 냉각 후 절단하였다. 절단된 당면을 6시간 동안 숙성시킨 후 예냉과 냉동처리 후 26∼30℃에서 18 시간 동안 당면을 건조하였다. 건조된 당면은 실온에서 보관하며 분석에 이용하였다(Jeon et al., 2015). 뽕잎당면의 함량별 배합비는 <Table 1>과 같다. 본 연구에서는 뽕잎분말 무첨가 일반당면(CON)과 뽕잎분말 0.5%, 1.0%, 1.5% 및 2.0% 첨가된 당면을 MD1, MD2, MD3 및 MD4로 명명하였다.

<Table 1>

Formulas for the manufacture of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder

4. 항산화능과 효소활성 측정

1) 추출물 제조

뽕잎분말과 뽕잎당면의 항산화능과 효소활성 측정을 위해 70% 에탄올 추출물을 제조하였다. 뽕잎분말과 뽕잎당면 무게 대비 각각 20배 부피의 70% 에탄올을 첨가한 후 48 시간 동안 homogenizers로 상온에서 추출하였다. 이렇게 2, 3차 추출액을 얻어 모두 혼합한 후 감압농축기(HS-2005S-N, Hahn Shin Scientific Co., Kyounggi, Korea)로 용매를 증발시켜 농축액을 동결건조기(FD8508, Shinbiobase, Kyonggi, Korea)를 이용하여 동결건조 후 분말화하여 –70℃ deep freezer에 보관하면서 시료로 사용하였다.

<Table 2>

Operating conditions and data acquisition parameters for ICP-MS

2) Total polyphenol 함량 측정

총 페놀 함량은 Arnous et al.(2001)의 방법을 수정하여 측정하였다. 추출물 500 μL을 취하고 2N Folin-Ciocalteu 시약 50 μL를 가하여 실온에서 3분간 방치한 후, 20% Na₂Co₃용액 500 μL을 가하여 이 혼합액을 25 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이 혼합물에서 100 μL을 취해 ELISA (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio., Seoul, Korea)을 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 tannic acid를 이용하여 표준곡선을 작성하고 총 폴리페놀 함량을 계산하였다. 시료는 3반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였다.

3) DPPH radical 소거능 측정

DPPH free radical 소거능은 Jeong et al.(2010)의 방법을 수정하여 측정하였다. 96 well micro plate에 추출물의 농도를 Dose dependent 하게 희석한 100 μL의 추출물에 각각 0.1 mM DPPH ethanol 용액 100 μL을 첨가한 후, 30분간 실온에 방치하여 517 nm에서 ELISA (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio., Seoul, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때 농도별 전자공여능은 백분율로 표현하였고, IC₅₀(The half maximal inhibitory concentration)저해 농도는 μg/mL 단위로 표시하였다. 시료는 3반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였으며 free radical 소거능 계산식은 다음과 같다.

$\[ \mathrm{f}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{ }\mathrm{소}\mathrm{거}\mathrm{능}\left(\mathrm{\%}\right)\mathrm{ }=\mathrm{ }\left[\right(1–\mathrm{반}\mathrm{응}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도})/\mathrm{대}\mathrm{조}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도}]\mathrm{ }\times \mathrm{ }100 \]$

4) ABTS radical 소거능 측정

ABTS free radical 소거능은 Jeong et al.(2010)의 방법을 수정하여 측정하였다. 7.4 mM ABTS 용액에 2.6 mM Potassium phosphate를 첨가한 후 24시간 냉동보관하고 1배 PBS buffer 용액을 15배 희석하여 732 nm에서 흡광도를 0.700±0.03(mean±SD)로 맞춰 ABTS regent로 사용하였다. 제조한 ABTS regent 950 μL와 추출물의 농도를 Dose dependent 하게 희석한 각각 추출물을 50 μL씩 투여하여 실온에서 5분간 반응 시킨 후, ELISA (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio., Seoul, Korea)를 사용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 농도별 전자공여능은 백분율로 표현하였고, IC₅₀ 저해 농도는 μg/mL 단위로 표현 하였다. 시료는 3반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였으며 free radical 소거능은 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.

$\[ \mathrm{f}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{ }\mathrm{소}\mathrm{거}\mathrm{능}\left(\mathrm{\%}\right)\mathrm{ }=\mathrm{ }\left[\right(1–\mathrm{반}\mathrm{응}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도})/\mathrm{대}\mathrm{조}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도}]\mathrm{ }\times \mathrm{ }100 \]$

5) Angiotensin I-converting enzyme 저해능 측정

Angiotensin I-converting enzyme(ACE)저해 활성은 Cushman & Cheung(1971)의 방법에 따라 측정하였다. 조효소액은 rabbit lung acetone powder(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 Msodium borate buffer(pH 8.3)에 1 g/mL (w/v)의 농도로 4℃에서 24시간 추출한 후, 4℃, 4,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다.

<Table 3>

Isotopes of elements and measured value by Agilent Multi-Element Calibration Standards

기질은 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 HHL(hippuryl-histidyl-leucine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 5 mg/mL(w/v)의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE 저해활성은 시료 50 μL에 ACE 조효소액 50 μL을 가한 다음 37℃에서 5분간 예비 반응시킨 후, 기질 50 μL을 가하고 다시 37℃에서 1시간 반응시켰다. 150 μL의 1 N HCl로 반응을 정지시키고 750 μL의 ethyl acetate를 가한 후, 1분간 교반하고 4℃, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 500 μL의 상등액을 얻었다. 이 상등액을 120℃에서 30분간 완전히 건조시켜 2 mL의 메탄올을 넣은 후 ELISA(Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio., Seoul, Korea)를 이용하여 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 추출물 대신 추출용매 50 μL을 가해서 실험하였다. 시료는 3반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였으며 ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.

$\[ \mathrm{저}\mathrm{해}\mathrm{율}\left(\mathrm{\%}\right)\mathrm{ }=\mathrm{ }\left[\right(1-\mathrm{반}\mathrm{응}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도})/\mathrm{대}\mathrm{조}\mathrm{군}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{흡}\mathrm{광}\mathrm{도}]\mathrm{ }\times 100 \]$

6) α-glucosidase 저해활성 측정

뽕잎분말과 뽕잎당면 70% 에탄올 추출물 시료의 α-glucosidase 저해활성 분석은 Kim et al.(2004b)의 방법에 따라 측정하였다. 96 well plate를 이용하여 시료 50μL에 0.7 unit α-glucosidase 효소액(G5003, (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 μL를 첨가하여 혼합한 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1.5 mMρ-NPG (p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 기질액을 50 μL 넣고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 1 M Na₂CO₃ 1 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤, Anthos 2020 microplate reader (Cambridge, England)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-glucosidase 저해활성을 비교하기 위하여 양성 대조군으로 acarbose를 사용하여 측정하였다. 시료는 3반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 무기질 함량

뽕잎당면의 무기질 함량 분석 결과는 <Table 4>와 같다. 뽕잎당면에 함유된 무기질은 나트륨(Na), 마그네슘(Mg), 칼륨(K), 칼슘(Ca), 구리(Cu), 아연(Zn) 순으로 나타났으며 모든 항목에서 대조군과 첨가군간에 유의적인 차이를 보였다(p<0.001). 나트륨(Na)은 대조군(43.52 mg)에 비해 첨가군의 Na함량이 크게 증가하였으나 첨가군간에는 유의적인 차이가 없었다. 마그네슘(Mg)은 대조군이 33.97 mg으로 가장 낮은 값을 보였으며 MD3가 85.27 mg으로 가장 높은 값을 보였다(p<0.001). 대조군의 칼륨(K)은 51.48 mg이었으나 MD3와 MD4가 396.90∼396.08 mg으로 높게 나타나 두 시료간에는 유의적인 차이는 없었다. 칼슘(Ca)은 대조군이 213.30 mg으로 뽕잎분말 첨가에 따라 첨가군의 칼슘의 함량이 증가하였으나 MD3(0.24 mg)와 MD4(0.25 mg), MD1(0.19 mg)과 MD2(0.21 mg) 각각의 시료간에는 유의적인 차이가 없었다. 구리(Cu)의 경우 대조군은 0.15 mg, 첨가군은 0,19∼0.25 mg으로 뽕잎분말첨가에 따른 증가가 높지 않았다. 아연(Zn)은 대조군은 0.52 mg으로 가장 낮은 값을 보였으며 MD4가 3.02 mg으로 나타났으며 첨가군간에 유의적인 차이를 보였다. Kim et al.(2003)의 연구에서 뽕잎 중에는 섬유질 함량은 52%이며 각종 무기질과 섬유질 함량이 매우 높으며 특히 칼슘 2,699 mg, 철분 44 mg, 칼륨 3.100 mg으로 함유량이 높다고 보고하였다. 본 연구에서도 뽕잎분말을 첨가한 당면의 경우 무첨가 당면보다 Ca, K 등의 무기질 함량이 높게 나타났다. Kim et al.(2000)의 뽕잎가루를 첨가한 뽕잎절편 연구에서 뽕잎가루 첨가량이 증가할수록 절편의 무기질 함량이 유의적으로 증가하였다는 보고와 동일한 결과를 보였다.

<Table 4>

Mineral contents analysis of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder by ICP_MS (unit : ppm, mg/kg)

2. Total polyphenol 함량

뽕잎분말과 뽕잎당면의 총 폴리페놀 함량은 <Table 5>와 같다. 식물계에 널리 분포되어 있는 페놀화합물은 phenolic hydroxy group을 가지고 있어 단백질 또는 효소 단백질, 기타 2가 금속이온 및 거대분자들과 결합하는 성질을 가지며 항산화 및 항미생물 효과를 나타낸다(Kim, 2005). Kim & Seok(2013)은 과일이나 채소에 다량으로 함유된 천연 항산화 물질들이 뽕잎에도 다량 함유되어 있으며 특히 어린 뽕잎의 항산화능이 가장 높다고 보고하였다. Park et al.(2014)은 Total polyphenol은 Anthocyanin과 anthoxanthine을 포함하는 비질소성 식품색소로 지질 과산화에 대한 항산화제의 기능을 가진다고 하였는데 본 연구에 사용된 뽕잎분말의 총 폴리페놀 함량은 82.01 mg TAE/g이었다. 뽕잎분말 무 첨가 대조군과 뽕잎분말이 첨가된 비교군들의 총 폴리페놀 함량은 각각 CON 2.84 mg TAE/g, MD1 9.27 mg TAE/g, MD2 15.27 mg TAE/g, MD3 17.80 mg TAE/g, 및 MD4 22.03 mg TAE/g으로 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 총 폴리페놀 함량이 유의하게 증가하였다(p<0.001). Park et al.(2014)의 뽕잎차의 Total polyphenol 분석결과 977±33.2 mg/100g ∼ 653±18.5 mg/100g으로 높은 함량을 보였으나 본 연구에서는 당면의 제조에서 첨가된 뽕잎분말의 양의 차이가 있어 함량에 차이가 있는 것으로 보인다. Jin(2013)의 뽕잎 분말 첨가 매작과 연구에서 뽕잎분말 첨가량이 증가할수록 매작과의 총 페놀함량이 증가하는 것으로 나타났는데 본 연구에서도 뽕잎분말의 영향으로 폴리페놀 함량이 증가한 것으로 판단된다.

<Table 5>

Total polyphenol contents of extracts of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder

4. Angiotensin I-converting enzyme 저해능 및 α-glucosidase 저해활성

뽕잎당면의 ACE(angiotensin I-converting enzyme) 저해효과에 대한 결과는 <Table 7>과 같다. 항고혈압 효소저해활성에 사용된 대조군인 captoprill은 500 μg/mL 수준에서 84.85% 억제효과를 나타냈다. 뽕잎분말은 150,000 μg/mL 수준에서 95.57% 억제효과를 나타났다. 대조군은 91.02%, MD1 93.60%, MD2 93.62%, MD3 93.43%, 및 MD4 94.21%으로 뽕잎분말 첨가량이 높아질수 록 ACE 저해활성이 유의하게 높게 나타났다(p<0.001). 본 연구결과 MD4의 ACE 저해활성뽕잎분말의 억제효과와 비슷한 수준으로 높은 억제효과를 보였다. Yang et al.(2012)의 뽕잎 추출액의 항고혈압 효과 연구에서 뽕잎 추출액이 고혈압 쥐에서 혈압을 낮추는 효과가 있으며, 상당한 ACE 저해 효과를 보인다는 결과와 유사함을 보였다. 따라서 뽕잎분말을 첨가한 당면에서 항고혈압에 효과가 있음을 보였다.

<Table 6>

DPPH IC50 Value and ABTS IC50 Value of extracts of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder

뽕잎당면의 α-glucosidase inhibitory effects 결과는 <Table 8>과 같다. 항당뇨 효소 활성검증에 사용된 positive control인 acarbose는 81.03% 억제효과를 나타냈다. 뽕잎분말은 61.23% 억제효과를 나타냈으며, CON 13.55%, MD1 25.06%, MD2 31.25%, MD3 31.25%, 및 MD4 46.49%로 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 유의하게 높은 활성을 보였다(p<0.001). 즉 뽕잎분말 첨가량이 높아질수록 α-glucosidase 저해활성이 우수하였다. Jang & Rhee(2004)의 뽕잎과 누에환의 혈당강하 연구에서 뽕잎환을 섭취한 쥐에서 α-glucosidase 활성 저해 효과 있다는 결과와 Chae et al.(2003)의 뽕잎의 기능성 분석 연구에서 뽕잎이 가지고 있는 GABA (γ-aminobutyric acid)성분과 필수 지방산인 γ-linolenic acid와 DNJ(dioxynozirimycine)가 다량 함유 되어 혈당개선에 효과가 있다는 결과로 보았을 때, 뽕잎분말의 첨가가 많은 당면일수록 항당뇨에 효과가 있는 것으로 보인다.

<Table 7>

ACE(angiotensin I-converting enzyme) inhibitory effects of extracts of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder

<Table 8>

α-glucosidase inhibitory effects of extracts of Dangmyon(starch vermicelli) added with mulberry leaves powder

Ⅳ. 결론

뽕잎분말을 첨가한 당면의 무기질 함량, 항산화능, 항고혈압, 항당뇨 효소활성 분석을 실시한 결과는 다음과 같다. 뽕잎당면의 무기질함량 분석 결과, 다량무기질(Na, Mg, K, Ca)과 미량무기질(Cu, Zn)의 함량이 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 값이 유의적으로 증가하였다(p<0.001). 뽕잎당면의 항산화 평가 결과, 총 폴리페놀 함량은 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 값이 유의적으로 증가하였다(p<0.001). 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능의 IC₅₀ value, ABTS 라디칼 소거능의 IC₅₀ value는 유의적으로 감소하였다(p<0.001). 항고혈압 및 항당뇨 효소 활성검증에 뽕잎분말의 첨가량이 증가할수록 유의적으로 값이 증가하였다(p<0.001). 이상의 결과, 뽕잎분말을 첨가하여 제조한 당면은 기존의 무 첨가당면보다 항산화능이 증가하였으며 항고혈압 및 항당뇨 효소활성이 높게 나타나 일반당면보다 생리활성이 향상된 기능성 당면이 되겠다.

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