다양한 식중독균과 식물병원균에 항균력을 갖는 토양유래 Streptomyces virginiae의 분리

Ⅰ. 서 론

Streptomyces 속에 속하는 균주는 그람양성 균이며, 해수, 식물의 주변과 같은 다양한 환경에 서식하는 것으로 알려져 있지만 주로 토양에서 발견된다 (Bouchek-Mechiche et al., 2006; Procópio et al., 2012). 이 균은 필라멘트형 균사를 형성하고 그 끝에 포자를 만들어 증식하는데 형태학적으로 곰팡이와 매우 유사하다 (Procópio et al., 2012). Streptomyces는 토양의 셀룰로오스 (Enger & Sleeper, 1965; Kluepfel et al., 1986; Spear et al., 1993)나 리그닌 (Pometto & Crawford, 1986)의 분해에 관여하며, 병원성 곰팡이, 세균, 바이러스의 생육을 억제할 수 있는 이차대사산물을 생산하는 것으로 알려져 있다(Rifaat & Kansoh, 2005; Wright & Hopwood, 1976). 이 이차대사산물은 미생물들의 생육을 억제하는 것 외에도 항 고혈압 작용과 면역 억제제 작용을 한다고 알려져 있다(Omura et al., 2001).

Streptomyces를 포함하는 방선균들은 10,000 종류 이상의 생리활성물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데 이 중에서 7,600 여 종류 이상이 Streptomyces 속이 생산하는 물질 (Bérdy, 2005)이며 이 생리활성물질의 75 %가 의약분야에서, 60 %가 농업분야에서 활용되고 있다(Miyadoh, 1993). 이 외에도 이 균은 폐기물 처리 (Kim et al., 1999), 식품의 보존제 및 첨가제 (Wright & Hopwood, 1976) 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. Streptomyces 속 유래 생리활성물질이 발굴되어 다양한 산업분야에서 활용되고 있지만 (Bérdy, 2005), 현재까지 진행되어온 연구에서는 Streptomyces 속이 분비하는 항균물질이 그람양성균에만 항균효과를 보였거나(Wright & Hopwood, 1976), 식물병원균 또는 소수의 병원균에 대해서만 항균효과를 보였다(Saengnak et al., 2013). 식중독균과 식물 병원균에 대해 동시에 항균 활성인 보인 Streptomyces 속을 발굴한 적은 거의 없었다. 따라서 사람, 동물, 식물등에게 병을 유발하는 병원균을 동시에 억제할 수 있는 신규 미생물을 발굴하는 연구는 계속적으로 필요하다.

본 연구의 목적은 다양한 환경 (토양, 식품, 식품 접촉 표면)으로부터 미생물을 분리하여 식중독균 (Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus)과 식물병원균 (Aspergillus flavus, Fusarium graminearum)에 동시에 항균활성을 갖는 길항미생물을 발굴하는 것이다.

Ⅱ. 연구방법

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 토양, 식품, 식품 접촉 표면으로부터 미생물의 분리

<Table 1>은 토양, 식품, 식품 접촉 표면에서 분리한 미생물의 개수이다. 토양으로부터 분리된 미생물은 1,691개, 식품 샘플로 신선채소와 수산물에서 분리된 미생물은 각각 208개와 102개였으며, 식품 접촉 표면 샘플로 도마와 칼에서 분리된 미생물이 각각 51와 54개로 토양, 식품, 식품 접촉 표면으로부터 총 2,106개의 미생물을 분리하였다. 토양에서 가장 많은 수의 미생물을 분리하였고 그 다음으로 식품과 식품 접촉 표면의 순서였다.

<Table 1>

Numbers of microorganisms isolated from soil, foods and food-contact surfaces

2. 토양, 식품, 식품 접촉 표면으로부터 분리한 미생물들의 위해 미생물에 대한 항균력 확인

토양, 식품, 식품 접촉 표면으로부터 분리한 미생물 (2,106 개) 중에서 E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. aureus, V. parahaemolyticus, A. flavus, F. graminearum에 대한 항균력을 double layer assay를 이용하여 확인했을 때, 6 개의 병원균에 대해 동시에 항균 활성을 나타낸 균주는 토양에서 분리한 미생물 1개 뿐이었다. <Table 2>은 토양에서 분리한 미생물을 이용하여 double layer assay로 E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. aureus, V. parahaemolyticus, A. flavus, F. graminearum에 대해 항균력을 확인했을 때 저해환의 크기를 면적으로 환산한 값이다. 토양에서 분리한 미생물은 S. aureus (4.52 cm²)>L. monocytogenes (3.80 cm²)>E. coli O157:H7 (2.54 cm²)> F. graminearum (1.78 cm²)>V. parahaemolyticus (1.54 cm²)>A. flavus (0.38 cm²)의 순서로 큰 저해환을 형성하였다. 이 결과로 보았을 때 분리한 토양유래 미생물은 S. aureus에 대해 가장 우수한 항균력을 보였고 A. flavus 에 대해 가장 적은 항균력을 나타내었다.

<Table 2>

Antimicrobial activity of isolates from soil, foods, and food contact surfaces against S. aureus, E. coli O157:H7, L. monocytogenes, V. parahaemolyticus, A. flavus, and F. graminearum.

3. 길항미생물의 동정

[Figure 1]는 6 종류의 위해 미생물에 대해 항균력을 보였던 토양 유래 미생물의 16S rRNA 유전자를 이용하여 phylogenetic tree를 그렸을 때 Streptomyces virginiae에 가깝다는 것을 보여주는 결과이다. 이 토양 유래 미생물의 16S rRNA의 유전자 정보는 NCBI에 등록된 S. virginiae NBRC 3729의 유전자 정보와 가장 가깝게 나타났다. 이 미생물이 S. virginiae가 맞는지를 확인하기 위하여 Streptomyces spp.를 동정할 수 있는 ISP 배지를 사용하여 배양 특성을 확인해 보았다. <Table 3>는 6 종류의 위해미생물에 대해 동시에 항균력을 보였던 토양유래 미생물을 ISP 배지에 획선 도말하여 14일 동안 배양했을 때 배양상 특징을 나타내는 결과이다. 이 미생물은 ISP 1, 2. 3. 4. 5. 6번 배지에서 모두 잘 자랐다. ISP 배지에 형성된 기균사의 색은 ISP 1, 5, 6번 배지를 제외하고 대부분 회색에 가까웠다. ISP 1, 5, 6 배지에서는 기균사를 약간 형성하였거나 형성하지 않았다. 배양배지의 뒷면에서 확인할 수 있는 기저균사체의 색은 ISP 1과 6번 배지를 제외하고 모두 노란색에 가까웠고, ISP 1 배지에서는 갈색, ISP 6 배지에서는 자줏빛 흑색을 띄었다. ISP 배지에서 색소를 생성하는지를 확인했을 때 ISP 6번 배지에서만 자줏빛 흑색의 색소를 생성하였고 나머지 배지에서는 색소를 형성하지 않았다. ISP 2, 3, 4번 배지에서 기균사의 색이 회색, 그리고 ISP 2, 3, 5번 배지에서 기저균사체의 색이 노란색이며 색소를 형성하지 않는 특징이 에 기록되어 있는 S. virginiae와 유사했다. 또한 Boeck et al. (1885)의 ISP taxonomy test 결과에서 언급하고 있는 포자의 색이 회색이라는 것과 기저균사체가 노락색이라는 것이 우리의 결과와 유사했다. NCBI에서 등록된 S. virginiae와의 유전자 정보가 유사하고 문헌에 기록되어있는 배양 배지에서의 특징이 S. virginiae와 유사했기 때문에 우리는 이 균을 S. virginiae로 명명했다.

[Figure 1]

Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence showing the phylogenetic relationships between the isolate with antimicrobial activity against six pathogens and Streptomyces species. Bootstrap values of 1000 replications are shown at the branch points

<Table 3>

Cultural characteristics of the isolates showing antimicrobial activity against S. aureus, E. coli O157:H7, L. monocytogenes, V. parahaemolyticus, A. flavus, and F. graminearum

Ⅳ. 결론 및 논의

소비자들이 건강하고 안전한 삶을 지향함에 따라 식품, 농업, 환경, 의약품 산업 분야에서 화학적 합성물 보다 천연물 제재의 사용에 관심이 증대되고 있다. 이에 대응하기 위하여 전 세계 다국적 기업 및 연구 기관에서 식물 및 미생물에 관련된 천연물 제재를 발굴하고 제품으로 개발하고 있지만 천연물 제재의 발굴에 한계가 있어 개발되고 있는 제품의 종류가 매우 제한적이다. 그러므로 다양한 천연물 제재가 함유된 제품을 개발하기 위해서 천연물 제재의 발굴은 계속 연구되어야 한다. 본 연구의 목적은 다양한 식중독균과 식물병원균을 동시에 억제할 수 있는 길항 미생물을 발굴하고 이 미생물이 다양한 산업 분야에서 활용 될 수 있는 안전한 미생물인지 확인하기 위하여 동정하는 것이다.

토양, 식품, 식품 접촉 표면에서 분리된 2,106개의 미생물 중 6 종류의 위해 미생물 (E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. aureus, V. parahaemolyticus, A. flavus, F. graminearum)에 대해 항균력을 나타내었던 균주는 토양에서 분리한 S. virginiae 1개 뿐이었다. 대부분의 미생물 (1,962개)이 6 종류의 위해 미생물 중 1개의 위해 미생물에 대해 항균력을 나타내었고 2 개의 위해 미생물에 대해 동시에 항균력을 보였던 미생물의 수는 72개, 3 개의 위해 미생물에 대해 항균력을 보였던 미생물의 수는 41개, 4 개의 위해 미생물에 대해 항균력을 보였던 미생물의 수는 29개, 5 개의 위해 미생물에 대해 항균력을 보였던 미생물의 수는 1개로 여러 종류의 위해 미생물에 대해 동시에 항균력을 나타내는 미생물의 수는 위해 미생물의 수가 증가할수록 감소하였다. 다른 연구자의 연구에서도 위해 미생물에 대해 항균력을 나타내는 미생물을 분리한 사례는 많이 있었다. Brashears et al. (2003)은 소의 분변에서 E. coli O157:H7을 억제하는 Lactic acid bacteria를 분리했다고 보고했다. Kim et al. (2013)도 새싹종자와 새싹채소로부터 E. coli O157:H7을 억제하는 Paenibacillus polymixa를 분리했다고 보고하였다. Khleekorn과 Wongrueng(2014)도 바나나에 탄저병을 유발하는 병원균인 Colletotrichum musae를 억제하는 길항 미생물을 분리하였다고 보고하였다. 이처럼 위해 미생물에 대해 항균력을 나타내는 길항 미생물을 발굴하려는 시도는 많이 연구되어 왔지만 우리의 연구에서처럼 식중독균과 식물병원균을 포함하는 다양한 위해 미생물에 대해 항균력을 보이는 길항 미생물을 발굴하고자 시도한 사례는 거의 없었다.

우리가 동정한 S. virginiae는 식중독균과 식물병원균에 항균력을 나타내었다. 다른 연구자의 보고에서도 S. virginiae가 다양한 종류의 박테리아, 곰팡이, 효모에 대해 항균력을 나타내었다는 연구 보고가 있었다. Rifaat 와 Kansoh (2005)가 이집트 토양으로부터 S. virginiae를 분리했고 다양한 미생물에 대해 항균력을 확인했다. 그들은 Bacillus spp., Sarcina lutea, S. aureus, Escherichia coli, Pesudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae에 대해 항균력을 나타내었다고 보고하였다. S. virginiae는 virginiamycin이라는 항균 물질을 내는 것으로 알려져 있다. 아마도 이 항균물질이 6 종류의 위해 미생물에 대해 항균 효과를 낸 것 같다. Di Giambattista et al. (1989)도 S. virginiae에 의해 생산되는 virginiamycin은 다양한 종류의 그람양성균에 대해 효과적이었다고 보고했다. Papich와 Riviers (2009)도 S. virginiae에 의해 생산되는 virginiamycin이 대부분의 그람양성균, 그람음성균인 Haemophilus spp., Neisseria spp., 프로토조아인 Toxoplasma spp.에 항균 효과가 있었다고 보고하였다.

우리가 분리한 S. virginiae는 다양한 미생물에 동시적으로 항균력을 나타내므로 식품, 농업, 환경 산업 등에 넓게 적용시킬 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어 식품 산업 현장에서는 다양한 위해 미생물이 유입될 수 있는데, 이 미생물을 식품 접촉 표면 등에 바이오필름으로 유도한다면 유입되는 여러 위해 미생물에 대해 동시적으로 항균성을 부여할 수 있을 것으로 예상된다.

본 연구에서는 다양한 환경에서 분리한 2,106개의 미생물을 이용하여 6 종류의 식중독균과 식물병원균에 대해 모두 항균력을 나타내는 미생물을 분리하였고, 이 미생물은 S. virginiae 로 동정되었다. 본 연구의 개발은 식품, 의약품, 농업 분야에서 사용 할 수 있는 약제를 개발할 때 기초 자료로 활용할 수 있을 것이다.

Acknowledgments

본 연구는 한국연구재단 (NRF-2013R1A2A2A01068475)에서 재원을 지원받아 수행하였습니다. 이 논문은 2014년도 한국생활과학회 동계 학술대회에서 포스터 발표한 것을 확장한 것임.

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